講堂精粹 | Annexin V凋亡檢測實驗詳解

細胞凋亡(Apoptosis)

又稱細胞程序性死亡(Programmed cell death),是一種為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的主動的死亡。凋亡的紊亂與腫瘤、自身免疫性疾病的發生具有直接或間接的關系,在細胞領域具有重要的研究價值。

細胞凋亡是個復雜的過程,不同的凋亡時期具有不同的檢測方法。

其中磷脂酰絲氨酸(PS)外翻分析(Annexin V)是檢測細胞早期凋亡最常見的方法。原理很簡單,即細胞發生凋亡時,位于細胞膜內的PS外翻到細胞膜表面,暴露于細胞外環境中。和偶聯熒光染料的Annexin V特異性結合,同時加上核酸染料(它只能穿透死細胞膜)如PI,這樣便可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

接下來,小柏為您講解下Annexin V檢測凋亡的詳細實驗步驟。

01

細胞處理和染色

細胞處理是凋亡實驗中很重要的步驟,必須在單細胞懸液的狀態下進行后續的染色。

對于貼壁細胞,用不含EDTA的胰酶進行消化(注:對于比較難消化的細胞,也可以用含低濃度EDTA的胰酶消化,最后細胞多洗幾遍,減小EDTA鰲合鈣離子產生的影響),收集細胞懸液進行計數;懸浮細胞可直接計數;對于組織樣本,需要將其消化成單細胞懸液才可以進行后續實驗。具體實驗流程如下:

這里要特別提醒一下大家——

貼壁細胞進行消化的時候,消化時間過長會造成細胞膜的損傷,導致Annexin V假陽性;PI具有細胞毒性,染色時間也不易過長,盡量在一小時內上機。

02

實驗設計

流式的對照一直很令人頭疼,空白管、陰性管、單陽管、陽性管都是啥意思?它們的目的是什么?每一次實驗都需要做嗎?

別急,今天小柏來為你們解惑。

細胞用流式儀器檢測時,需要在一個合適的實驗模板里進行信號的收集,即模板里包含所有染色抗體對應的熒光通道,而且包括散射光和熒光通道在內的各個通道的電壓要合適(信號既可以被清晰地看到,又不會跑到視野外)。

因此,在第一次做凋亡實驗時,需要用空白對照和單陽管調節電壓和補償,建立一個新的合適的實驗模板,后續的實驗(相同的儀器、同一批細胞系、同樣的染色方案條件)可以不必再重新設置電壓和補償。陰性管和陽性管在實驗條件穩定、細胞分群明顯的情況下,也可以不必再使用。

具體的實驗設計方案如下:

空白管:未經任何處理的陰性對照組細胞,不加Annexin V和PI。用于調節電壓

單染管:經過處理的發生凋亡的細胞,分別加Annexin V和PI。用于調節補償。

陰性管:未經任何處理的細胞,加Annexin V和PI。目的是排除細胞自身凋亡以及實驗操作過程帶來的凋亡和壞死。用于確定正常細胞狀態,排除假陽性

陽性管:經過處理的確定發生凋亡的細胞,加Annexin V和PI。用于確認試劑、儀器、操作沒有問題。

檢測管:處理的細胞,加 Annexin V和PI。用空白管和單染管調節好電壓和補償后,獲得所需要的流式數據。

03

數據分析

流式數據的分析是獲得結果的最后一步,一定要重視,否則實驗就前功盡棄了。我們應該如何操作,才能得到漂亮準確的流式圖呢?

簡單總結,就是調節補償、設門和結果統計。

PART

ONE

調節補償

補償的調節是因為熒光通道之間存在光譜重疊的現象,需要把目的通道里任何其他的干擾信號去掉。

前面提到用單陽管來調節補償,在流式細胞儀上可以手動調節,也可以自動調節。當然,也可以采集完所有數據之后,用FlowJo V10軟件調節,不過小柏還是最喜歡在儀器上調節補償,因為調節好補償收集數據時,我立馬就可以知道這次的實驗結果好不好了。

PART

TWO

設門

補償調節后,接下來就是設門了。

首先,

在FSC和SSC圖上

圈出目的細胞群

,注意不要圈到碎片;其次,

在Annexin V和PI熒光通道畫十字門,以對照組細胞同時加了Annexin V和PI的陰性對照組來界定門的位置,結合數據的實際情況進行微調

。同一批實驗,最好用統一的十字門。其實Annexin V凋亡實驗,通常情況下細胞分群還是挺好的,比較容易設門。

下面流式圖是用四正柏的Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測的一個凋亡樣本。

我們通過十字門,將細胞分為了四個象限,分別對應了四種不同的染色情況。左下象限是健康的活細胞,用Annexin V-/PI-表示,右下象限是早期凋亡的細胞,用Annexin V+PI-表示,右上象限為晚期凋亡的細胞,但實際情況中,也包括了一部分壞死細胞,但是比例較少,用Annexin V+PI+表示,左上象限是非程序化死亡的細胞(不經凋亡,沒有PS外翻,但是細胞存在機械性壞死,導致核酸染料進入),用Annexin V-PI+表示。

小柏在這里再跟大家強調一下:主細胞圈門的時候,一定要

排除掉細胞碎片

。同時,有的細胞誘導凋亡后皺縮明顯,

側群也會存在凋亡的信號

,如下圖所示,這樣的信號也要圈進來,避免凋亡信號丟失而影響后續的結果分析。

PART

THREE

結果統計

凋亡實驗中主要分析早凋的細胞比例,不過具體也要看實驗目的,做三個重復之后,便可以統計數據了。

最后,小柏給大家補充說明一些凋亡實驗中經常遇到的問題。

01

我的細胞轉染了帶GFP的質粒,哪個試劑盒比較適合我?如何進行實驗設計?

推薦用Annexin V Alexa Fluor647/PI凋亡檢測試劑盒,不僅避開了FITC通道,而且Alexa Fluor 647和PE通道減少了調節補償這個步驟。

實驗設計如下:

1. 空白細胞,不帶轉染GFP的質粒,用于調節電壓。

2. 轉染GFP的空質粒對照組,不加Annexin V和PI,用于調節補償。

3. 轉染帶有一段基因的GFP質粒,不加Annexin V和PI,用于設門對照。

4. 轉染帶有一段基因的GFP質粒,加Annexin v和PI,即實驗組。

02

細菌和藻類可以用Annexin V試劑盒檢測凋亡嗎?

都可以的。用植物檢測凋亡時要先用果膠酶去除細胞壁。

03

Annexin V方法檢測凋亡適合所有的細胞嗎?

某些細胞的細胞膜外表面帶有大量的PS,因此不能使用該方法(比如巨核細胞、血小板、某些骨髓系細胞)。

04

細胞上清需要收集嗎?

需要收集,因為上清也會有一些凋亡的細胞。最后與消化的單細胞懸液混合,進行染色。

05

Annexin V-PI+象限屬于什么細胞?

一般認為是機械性壞死細胞。對于懸浮細胞,多數都是細胞膜丟失得差不多了;而對于組織細胞或貼壁細胞,則多為消化、刮擦等導致的膜損傷。Annexin V-PI+細胞因過度消化、高速離心、大力吹打,而使膜受損。受損只是通透性增強,PS并沒外翻。所以,小分子的PI進入,蛋白大分子的Annexin V被擋在外面。一般Annexin V-PI+細胞比例建議控制在5%以內。

06

MTT法在酶標儀上檢測時,有明顯的藥物濃度趨勢,但用流式檢測時,卻看不到這樣的趨勢,這是什么原因?

MTT和Annexin V檢測原理不同,它主要是用于測細胞活力,反映細胞線粒體內琥珀酸脫氫酶的活性,并不完全代表細胞的凋亡、周期阻滯或壞死。一些死細胞、碎片會造成OD值增高,產生假陽性結果。最好以流式檢測為準,兩種方法檢測趨勢一致時,實驗結果更易被信服。

07

凋亡結果怎樣可以接受?

一般情況下,正常細胞的早期凋亡率約5%左右,經凋亡誘導的細胞的早期凋亡率明顯上升,有的20-30%,有的30-40%,不同類型的細胞有差異;即使同種細胞,前后兩次實驗的細胞狀態不一致時,凋亡率也會不一致,通常三次實驗后做統計學分析。

08

如果細胞帶有RFP熒光或者用阿奇霉素處理過,該選用什么試劑盒?

避免使用PI通道的試劑盒。推薦用Annexin V-FITC/7-AAD凋亡檢測試劑盒(FXP145)Annexin V-Alexa Fluor 488/7-AAD 凋亡檢測試劑盒(FXP146)

09

血液樣本檢測凋亡該如何處理?

務必去除血液中的血小板,因為血小板含有PS,容易與Annexin V結合,從而干擾實驗結果。可以使用含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板。

10

如何同時進行Annexin V凋亡染色和表面染色?

建議Annexin V和表面染色分開進行。表面染色后,在PBS里洗細胞,離心,然后在Binding Buffer(含鈣離子)里進行Annexin V染色。

今天有關Annexin V凋亡實驗的內容就結束了,如果大家有問題,歡迎隨時咨詢小柏,或者直接聯系您身邊的四正柏人,我們將竭力為您提供最優質的產品和服務。

科研路上,我們一直在陪伴您!

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